Подбор праймеров

Праймеры — это короткие одноцепочечные нуклеотиды, с которых Taq-полимераза начинает синтез комплементарной цепи.

Детальная методика подбора праймеров зависит от цели проведения ПЦР (дифференциация видов, реамплификация плазмиды с введением сайтов рестрикции, мутагенез и др). Ниже мы остановимся на некоторых общих правилах.

1. Праймер должен быть комплементарен цепи, к которой вы подбираете праймер. При этом чтение праймера происходит всегда в направлении 5′ - 3′.

2. Температура отжига праймера должна лежать в диапазоне 55-65°С, различия в расчетной температуре для праймеров в паре должны превышать 5°С. Для достижения специфичного отжига праймера, при необходимости, следует дифференцировать последовательности с близким нуклеотидным составом, достаточно, чтобы праймеры отличались двумя нуклеотидами на 3′-конце.

3. Длина праймера должна составлять 16-30 нуклеотидов, при этом GC состав должен составлять 40-60%. Основания G и C имеют более прочную водородную связь и способствуют стабильности праймера. Следите за тем, чтобы не было слишком много повторяющихся оснований G или C, так как это может привести к образованию праймера-димера.

4. На протяжении пяти нуклеотидов 3′-конце праймера желательно нахождение двух G или C. Следует избегать 3′-концевой Т.

5. Избегайте повторов трёх и более одинаковых нуклеотидов подряд или динуклеотидных повторов.

6. При подборе праймеров необходимо избегать внутрипраймерной гомологии (более трёх комплементарных оснований внутри праймера) или межпраймерной гомологии (прямой и обратный праймеры имеют комплементарные последовательности). При несоблюдении этих правил возможно возникновение «шпилек» (комплементарные участки внутри праймера соединятся между собой) или самодимеров (отжиг прямого и обратного праймера друг на друга, вместо целевой последовательности).

7. Проверяйте праймеры на образование «шпилек» и димеров. Значение ΔG должно быть больше -10 ккал/моль, более низкие значения свидетельствуют об образовании стабильных структур, способных повлиять на ход ПЦР.

8. Для расчета температуры отжига следует использовать программное обеспечение, основанное на алгоритме ближайших соседей (Nearest Neighbor). Необходимо тестировать пару праймеров в диапазоне температур отжига, отклоняющемся от расчетной.

Правила подбора TaqMan® зондов

Гидролизуемые зонды это олигонуклеотиды, несущие флуорофор и тушитель флуоресценции и не имеющие выраженной вторичной структуры; сайт их посадки обязательно находится между сайтами связывания праймеров. Пока флуорофор и тушитель находятся в составе одной молекулы, флуоресценция тушится. В ходе ПЦР Taq-полимераза, обладающая 5′-3′ экзонуклеазной активностью, разрушает зонд. При этом флуорофор и тушитель высвобождаются в раствор, и флуорофор начинает флуоресцировать. Уровень флуоресценции увеличивается пропорционально увеличению продукта реакции.

1. Сайт связывания зонда должен находиться между сайтами связывания праймеров. Расстояние до ближайшего праймера не имеет значения и может составлять и один нуклеотид.

2. Температура плавления зонда должна быть на 10°С выше температуры отжига праймеров для эффективного отжига зонда на цепь.

3. Длина зонда должна составлять 15-30 нуклеотидов при GC-составе близком к 30-80%.

4. Следует избегать присоединения флуорофора к основанию G, так как оно обладет эффектом тушения флуорофоров.

5. Флуорофор и тушитель могут располагаться как на 5′- или 3′ концах, так и в середине последовательности на dT. Для зондов длиной до 25 нуклеотидов целесообразно концевое мечение. Для зондов длиннее 35 нуклеотидов целесообразно ввести одну метку на 5′-конец, а другую на расстоянии 9-15 нуклеотидов на dT. При этом, чтобы зонд не мог служить праймером, следует заблокировать 3′-конец фосфатной группой.

6. Следует избегать последовательностей, имеющих протяженные участки самокомплементарности (стебли шпилечных структур), так как такая структура может быть деградирована полимеразой.

Зонды типа «молекулярный маяк»

Молекулярный маяк — это олигонуклеотид, имеющий только концевые метки (флуорофор и тушитель) и обладающий вторичной структурой «стебель-шпилька». Шпилька является участком, комплементарным матрице (сайт посадки, как и в случае гидролизуемых зондов, должен располагаться между сайтами связывания праймеров). Стебель состоит из комплементарных друг другу последовательностей, не относящихся к матрице. При отсутствии таргетной последовательности комплементарные участки последовательности в стебле гибридизуются, сближая флуорофор и тушитель, что приводит к тушению флуоресценции. Связывание зонда с таргетной последовательностью приводит к расплетанию его стеблевой структуры и увеличению интенсивности флуоресценции.

1. Температура плавления шпилечной части зонда должна быть на 7-10°С выше температуры плавления праймеров для эффективного отжига зонда на цепь.

2. Стебель должен состоять как минимум из 80% GC оснований и иметь длину 5-8 оснований.

3. Последовательность шпильки должна быть комплементарна матрице и иметь длину 18-30 оснований.

4. Флуорофор присоединяется к 5′-концу, тушитель к 3′ концу. Следует избегать присоединения флуорофора к основанию G, так как оно обладет эффектом тушения флуорофоров.

5. Необходимо проверять вторичную структуру зонда с помощью программ, моделирующих фолдинг ДНК, например, mfold. Необходимо избегать последовательностей, для которых моделируются неправильные вторичные структуры, особенно если их ΔG ниже, чем для правильной структуры.